Teknik Pengukuran Fotometri

TEKNIK PENGUKURAN FOTOMETRI

Dalam kimia klinik penggunaan fotometer untuk pengukuran secara fotometri sangat banyak dan hampir semua pemeriksaan kimia darah selalu menggunakan fotometer untuk menentukan kadar suatu zat terlarut dalam serum.

Fotometri merupakan teknik pengukuran menggunakan sinar, yang diukur adalah penyerapan sinar atau pelemahan sinar yang diberikan akibat interaksi reaksi antara sinar dengan panjang gelombang tertentu dilewatkan pada larutan zat warna yang akan ditentukan kadarnya. Penyerapan disini biasanya disebut absorbsi dan nilainya berupa absorben dalam angka desimal. Antara absorbsi dan transmisi sinar berbanding terbalik, semakin tinggi absorbsi maka semakin rendah nilai transmisi sinar yang diterima. Transmisi sinar biasanya disebut transmitted dan nilainya berupa transmittan dalam persen (%).

TEKNIK PENGUKURAN

1. Kinetik (Kinetic)

Teknik pengukuran ini adalah pengukuran fotometris dari perubahan absorben per satuan waktu baik menurun maupun meningkat. Pengukuran ini umumnya untuk mengukur aktifitas enzim, namun dapat juga digunakan untuk pengukuran suatu reaksi kimia yang kurang stabil seperti halnya kreatinin metode Jaffe kinetik 2 point. Kecepatan reaksi tersebut sangat tergantung dari suhu pengukuran, jumlah substrat, aktifitas enzim, pH larutan, waktu dan zat inhibitor enzim.

a. Kinetik Enzimatik (3 point)

• Kinetik Menurun (Decrease Reaction/Falling)

Pengukuran kinetik yang dilakukan untuk penentuan aktifitas enzim, yaitu kecepatan enzim untuk merubah substrat dengan test UV. Pengukuran secara fotometri aktifitas enzim berdasarkan penurunan absorben per satuan waktu. Pengukuran ini disebut pengukuran 3 titik, yaitu titik awal, kemudian titik kedua dan titik ketiga. Interval waktu dapat 20 detik (K-20) atau 60 detik (K-60). Substrat yang digunakan berisi NADH, LDH, Asam keto gluratarat dan L-alanine/L-aspartat dalam buffer pH 7,5. Dalam kebanyakan reaksi enzimatik, co-enzim NAD dapat direaksikan menjadi bentuk reduksinya NADH atau kebalikannya. NADH berlainan dengan NAD, mempunyai daya tembus yang kecil sekali terhadap sinar UV dengan panjang gelombang tertentu (340 nm) sehingga konsentrasi substrat atau aktifitas enzim dapat ditentukan melalui pengukuran. Enzim yang dapat ditentukan cara ini antara lain : AST, ALT, LDH, CK, HBDH dan Urea UV, dan lainnya.

• Kinetik Meningkat (Increase Reaction/Rising)

Pengukuran ini juga untuk mengukur kadar enzim yang melakukan aktifitas merubah substrat pada sinar 405 nm. Pengukuran ini juga menggunakan teknik pengukuran 3 titik seperti halnya decrease reaction diatas. Suatu larutan yang umumnya berisi Para-nitrophenyl phosphate berwarna kuning muda diubah menjadi p-nitrofenol yang berwarna lebih tua kuningnya. Kecepatan perubahan warna dari muda menjadi tua inilah yang diukur sebagai aktifitas enzim. Enzim yang dapat ditentukan aktifitasnya antara lain : ALP, ACP dan GGT.

b. Kinetik 2 Point

Pengukuran kinetik 2 point (2 titik) dengan cara melakukan pengukuran pada awal, kemudian dilanjutkan pada 2 menit selanjutnya. Hasil pengukuran berupa absorben rata-rata dikalikan dengan faktor kinetik akan didapatkan kadar bahan uji. Teknik pengukuran ini digunakan pada pemeriksaan kreatinin metode Jaffe without deproteinisasi. Kestabilan reaksi ikatan antara kreatinin dalam suasana alkali dengan asam pikrat dipengaruhi oleh adanya protein dalam serum.

2. Titik Akhir (End Point)

a. Blanko

• Blanko Udara

Teknik pengukuran dengan cara mengukur udara sebagai blanko dan dilanjutkan dengan pengukuran bahan uji. Dengan cara ini koreksi perubahan indeks bias larutan masih kurang teliti. Cara ini biasanya dilakukan pada pemeriksaan cara kinetik, yang mana tidak memerlukan perubahan indeks bias larutan, tapi perubahan konsentrasi larutan per satuan waktu.

• Blanko Aquabidest

Cara pengukuran ini sebagai baseline digunakan aquabidest, sehingga saat transmisi 100% atau aboserben 0,000 menggunakan medium aquabidest. Lalu dilakukan pengukuran blanko reagent, standard dan sampel. Cara inilah yang umum dilakukan pemeriksaan dalam kimia klinik rutin.

• Blanko Sampel

Cara ini dilakukan untuk mengurangi kesalahan akibat sampel yang berwarna atau keruh, sehingga perlu dilakukan penambahan sampel pada larutan blanko sehingga diukur sebagai blanko sampel. Cara ini digunakan pada pemeriksaan bilirubin total dan direk. Kemudian dilakukan pengukuran sampel dan dikalikan faktor maka didapatkan kadar bahan uji.

b. Faktor

Dalam bahasan ini membahas teknik pengukuran yang terkait dengan penggunaan blanko, namun sebagai acuan hasil/konsentrasi sampel dikalikan dengan nilai faktor. Cara ini efektif dan efisien dalam penggunaan reagensia, namun tidak selalu menunjukkan hasil yang baik apabila fotometer yang digunakan tidak lakukan penghitungan ulang faktor dengan bantuan standard atau bahan kontrol apabila : lampu yang digunakan telah tua atau lebih dari 3000 jam sehingga meredup, filter yang sudah tua, kuvet yang sudah memburam, pergantian merek reagensia dan suhu pengukuran yang berbeda. Oleh sebab itu sebaiknya penggunaan faktor ini diperbaharui secara berkala dengan bantuan standard atau serum kontrol/darah kontrol. Istilah ini disebut grade, baik upgrade value atau downgrade value dari faktor tersebut. Biasanya cara ini digunakan pada pengukuran kadar hemoglobin cara cyanmethemoglobin.

c. Standard

Cara pengukuran ini juga terkait dengan penggunaan blanko, namun sebagai acuan hasil/konsentrasi sampel berdasarkan hasil perkalian silang absoben sampel dengan konsentrasi standard dibagi dengan absorben standard. Cara lebih baik dibandingkan menggunakan faktor, namun yang paling berpengaruh adalah konsentrasi standard harus stabil dan memiliki simpangan baku (SD) dibawah 5% atau 1% tergantung parameter yang digunakan. Adanya kekeringan larutan standard akibat penyimpanan dalam suhu kulkas 2-8C karena terjadi penguapan menyebabkan lebih pekat sehingga kadar standar tinggi yang berakibat kadar sampel lebih rendah. Usaha untuk mengkoreksi dengan bantuan serum kontrol ketelitan dan ketepatan. Dikenal teknik pengukuran ini berdasarkan jumlah standar yang digunakan terdiri atas :

• Tunggal

Apabila pengukuran hanya berdasarkan atas 1 standar saja.

• Multipel

Apabila melebihi 1 standar dalam pengukuran. Biasanya ini digunakan pada pembuatan kurva kalibrasi standar. Apabila dideret standar tadi dengan kosentrasi yang rendah menuju tinggi, maka akan diperoleh kurva linear dengan kemiringan (slope) 45lurus, yang berarti pengukuran telah tepat dan baik. disamping itu akan diperoleh intercept dan coefisien variasi yang baik juga

3. Panjang Gelombang

Panjang gelombang (wavelenght) yang digunakan dalam pengukuran sangat penting dalam kimia klinik, hal ini karena kesalahan penggunaan panjang gelombang akan berakibat kesalahan pengukuran. Pada umumnya fotometer semiotomatik dan full analyzer telah diset parameter dan panjang gelombangnya sehingga kesalahan ini dapat ditiadakan.

Pada prinsipnya dalam pengukuran secara fotometer digunakan panjang gelombang dengan serapan maksimum, sehingga sinar yang diberikan akan diserap secara maksimum oleh larutan tersebut dan sisanya akan ditangkap detector. Berikut ini jenis panjang gelombang dan warna larutan yang diukur dalam fotometer pada umumnya

1. Panjang gelombang 340 nm Sinar ultra violet Warna Larutan Tidak berwarna berisi NADH, pemeriksaan secara enzimatik. (AST, ALT)
2. Panjang gelombang 405 nm Sinar biru Warna Larutan Larutan warna kuning, baik enzimatik (p-nitrophenyl phosphate) contoh : (ALP, ACP, GGT)
3. Panjang gelombang 492 nm Sinar biru muda Warna Larutan Larutan orange/jingga, pemeriksaan kinetik kreatinine Jaffe without deproteinisasi.
4. Panjang gelombang 546 nm Sinar hijau Warna Larutan Larutan merah, biru (kadang). pengukuran teknik end point sampel. Contoh : glukosa, cholesterol, asam urat, kreatinin deproteinisasi.
5. Panjang gelombang 578 nm Sinar kuning Warna Larutan Larutan hijau, biru, ungu dan kekeruhan putih dengan cara end point. Contoh : urea, albumin, kalium turbidity.
6. Panjang gelombang  624 nm Sinar orange merah Warna Larutan Larutan biru tua dan ungu. Jarang digunakan dalam kimia klinik.